منبع: بهداشت حیوانات، شماره 24
نام نویسنده/مترجم: مرضیه غفاری، کارشناس ارشد تغذیه طیور
1.انتقال ژن به وسیله اسپرماتوزوئیدها:
در ابتدای پیشرفت تکنیک های ترانس ژنیک به نظر می رسید که تنها اسپرماتوزوئیدهاابزار مناسب وراثت برای انتقال یک قطعه ژنتیکی خارجی به ژنوم حیوانات می باشند. Bracket و همکارانش در سال 1971 ثابت کردند که اسپرماتوزوئیدهای پستانداران قادرند که به DNA خارجی متصل شده و آن را در طی فرآیند باروری و لقاح به تخمک ماده ها منتقل کنند. عملکرد این روش در سال 1987 نیز برای طیور پیشنهاد شد. به طور کلی یک قطعه DNA به اسپرم باند می شود و این اسپر برای تلقیح ماده ها به کار می رود و اسپرمی که تخمک را بارور می کند ، حاوی ژن مورد نظر است که آن را به تخمک منتقل می کند و در نهایت آن ژن در جوجه ها ی هچ شده بروز پیدا می کند. اخیرا این روش در تولید پستانداران ترانس ژنتیک به کار می رود ، اما هنوز اطلاعات قانع کننده ای از این که انتقال ژن با واسطه اسپرم می تواند به طور موفقیت آمیزی ، ترانس ژن را به Germline منتقل کند در دسترس نیست .
2. روش ریز تزریق ِِDNA :
در این روش DNA را به کمک مکروپیپت به درون هسته سلول ها می فرستند. این DNA احتمال ادغام با ژنوم سلول میزبان را خواهد داشت. این روش یک روش عمومی برای معرفی ژن های خارجی به پستانداران می باشد ، که اغلب انتقال DNA به پیش هسته تخمک تازه بارور شده صورت می گیرد. اما استفاده از این تکنیک برای تزریق DNA به تخم پرندگان د مقایسه با پستانداران بسیار مشکل تر است. زیرا یک تخم تازه گذاشته شده مرغ حدوداً 000/60 – 000/50 سلول است. بنابراین ریز تزریق DNA به طور گسترده برای تخم مرغ های تازه به کار نمی رود.
اما روی رویان تازه بارور شده مرغ بعد از کشتن و جمع آوری تخم ها انجام می شود. تخم های ریز تزرق شده برای هچ به محیط گشت سه مرحله ای Exovo منتقل می شوند.
3.انتقال ژن به کمک رترو ویروس ها:
ناقل های رتروویروس یکی از ناقل های عمومی در انتقال ژن میباشند. و می توانند ژن های خارجی را به germliae طیور انتقال دهند. تکنیک های انتقال ژن با استفاده از رتروویروس ها به کرات برای ایجاد مرغ های ترانس ژنیک به کار رفته است. تیترهای بالای رترویروس ها امکان انتقال مورد نظر را به سلول های زیادی دارا است. به طور کلی رترورویروس ها شامل یک ژنوم از نوع RNA می باشند که یک هسته پروتئینی که حاوی آنزیم lntegrase می باشد ، قرار دارد.
پوشش پروتئینی ویروس به گیرنده های ویژه روی سلول میزبان متصل می شود. سپس اجزاء ویروس به وسیله میانجیگری گیرنده ها با استفاده از اندوستیوز به داخل ستوپلاسم میزبان وارد می شود. RNA ویروسی به CDNA که می تواند به داخل هسته منتقل شود ، کپی می شود و CDNA باDNA سلول میزبان یکپارچه می شود ( با استفاده از Integrase ) . این DNA متصل شده به DNA میزبان، به همراه سلول میزبان همانند سازی انجام میدهد و توارث آن نیز بر اساس ژنتیک مندلی صورت می گیرد.
DNA ویروسی الحاق یافته به ژنوم میزبان می تواند یک RNA ویروسی برای سنتزو پروتئین هایی که شامل یک پلیمر از ( pol ) و (gag ) و پروتئین های غشایی یا بسته بندی کننده ( Env ) ایجاد می کند. این سه دسته پروتئین یک پوشش ویروسی جدید ایجاد می کند و RNA ژنوم ویروسی را داخل آن بسته بندی کند. این کمپلکس جدید به غشاء سلول میزبان منتقل می شود و به خا رج سلول هدایت می شود. در انواع وکتورهایی که توانایی تکثیر دارنده ژن های ساختمانی و توالی های بسته بندی کننده ( Packaging) سالم و کامل هستند تا توانایی ادامه تولید ذرات ویروسی را داشته باشند که می توانند دیگر سلول ها را آلوده کنند. بنابراین وکتورهای رتروویروسی که قادر به تکثیر هستند به آسانی قادر به آلوده سازی تعداد کافی از سلول های زاینده و انتقال ژن مورد نظر به دومین و متعاقباً نسل های بعد را دارا است. اما در ایجاد طیور ترانس ژنیک با استفاده از رتروویروس هایی که توانایی تکثیر را دارند، قادر خواهند بود که دائماً ویروس را به محیط آزاد کنند. ( در اصطلاحبه آنها shedder گفته می شود ) . این امر وضعیت قابل قبولی نیست.
اما ناقل های رتروویروسی که توانایی تکثیر ندارند ( Replication-Defective-Retroviruses ) ، به این علت که ژن های pol یا gag یا env را که برای تکثیر لازم است ، ندارند ، ذرات جدید ویروس هایی ناقص هستند و آلودگی محیطی را کاهش می دهند. ناقل هایی که توانایی تکثیر ندارند ، استعداد آلوده سازی سلول های میزبان را دارند ، ولی توانایی ایجاد ذرات جدید ویروسی را ندارند. رتروویروس های ناقص یعنی آن هایی که توانایی تکثیر ندارند، توانایی ژن های خارجی با تعداد بازهای بیش از 10kb رادارند. زیرا آن ها بعضی از ژن های ضروری برای همانند سازی خود را از دست داده اند. ناقل های رتروویروسی جدید متکامل تر شده اند و بر پایه استراتژی های جدید حداقل آلودگی را ایجاد می کند. ) 1995,Thoraval ,1990,et al, Cosset Bosselman;1986,1978,silter )
4- انتقال مستقیم DNA به بیضه ها:
این روش در سال 1995 توسط مارشال گزارش شد. در این روش پتانسیل انتقل مستقیم DNA خارجی به بافت بیضه پایین است و از عوامل محدود کننده ان به شمار می رود. (2004,mazaziak et al )
5- انتقال ژن به کمک سلول های بلا ستومری:
سلول های بلا ستومری در کارهای ترانس ژنتیکی بسیار مفیدند،آن ها به راحتی از حیوان دهنده به حیوان گیرنده منتقل می شوند و به راحتی در تشکیل بافت های سوماتیک و بافت های جنسی یا germline شرکت می کنند. در محیط کشت چندین روز قابل نگهداری هستند و می توان بیان ژن های انتقال یافته را در آن ها قبل از انتقال به جنین در آزمایشگاه بررسی کرد. این ویژگی های آن ها باعث می شود که این سلول ها ناقل های ایده آلی برای تغیرات ژنتیکی جدید در germline باشند.
دراین تکنیک سلول ها استخراج مشوند. دستکاری می شوند و در نهایت در داخل یک رویان در حال رشد قرار می گیرند. با این هدف که یک جنین آمیخته ( Chimeric ) ایجاد شود که در germline آن ، ژن مورد نظر وجود دارد. در نهایت ایجاد نتایج G. که این نتایج با همدیگر آمیزش پیدا می کنند تا مرغ های 1G را ایجاد کنند که ترانس ژن را با خود حمل می نمایند. ( kamihira et al , 2004 ).
6- انتقال ژن به کمک سلول های cells PGC primordial germ ):
از زنانی که سلول های PGC به عنوان سلول های پایه در تولید اسپر ماتوزوآ و یا تخمک شناخته شدند ، استفاده از آن ها روش مفیدی در تولید طیوری ترانس ژنتیک می باشد. سلول های PGC ( سلول های جنینی اولیه ) منشأ germline در جنس طیور هستند، این سلول ها در مراحل ابتدایی تمایز جنینی ( مرحله دهم ) شروع به تمایز می کنند و در یک منطقه خارج جنین که به هلال زاینده ( Germ crescent ) منتهی می شود ، قابل استخراج اند. این سلول ها از هلال زاینده به برآمدگی گنادی در جنین ( Gonadol ridge ) توسط دو مکانیسم مهاجرت می کنند و در نهایت در ساختار germline شرکت می کنند.
1- به طور غیره فعال در یک گردش درون – خارج جنینی
( intra – extra embryonic circulation )
2- به طور فعال با به وجود آمدن خون و جریان خون این سلول ها را به اپیتلیوم لایه ی زاینده مهاجرت می کنند.
مقصد نهایی هر تغییری در ژنوم طیور سلول زاینده ( germline ) است. بهاین علت که این سلول ها سرانجام ژن انتقال یافته را به نسل های بعدی منتقل خواهند کرد.
سلول های PGC مرغ می توانند در خارج از بدن در یک محیط کامل از عوامل رشد ، تکثیر یافته و بعد از انتقال انتقال ژن به آن ها در تولید طیور ترانس ژنتیک استفاده شدند.
تزریق سلول های PGC ورتروویروس ها و سلو های بلاستومری به صفحه زاینده در جنس مرغ در یک تخم تازه بارور شده صورت می گیرد. با این امید که این سلول های تزریق شده در germline جنین قرار گرفته و یک مرغ ترانس ژنیک ایجاد شود که بتواند ژن را به نسل هی بعدی منتقل کند.
به طور کلی انتقال ژن با استفاده از رتروویروس ها و سلول های PGC از روش های عملی و مرسوم در انتقال ژن به ژنوم طیور می باشد ( 2004, Mazaziak et at ) .
مشکل ترین مرحله در ایجاد طیور ترانس ژنتیک انتقال ژن است. موقعی که پرنده های .G هچ می شوند ایجاد لاین در آن ها در مقایسه با انتقال ژن کار خیلی جزئی و ساده ای است.
